Makaleyi yazanlar: Khaoula El Hassouni, Muhammad Afzal, Kim A. Steige, Malte Sielaff, Valentina Curella, Manjusha Neerukonda, Stefan Tenzer, Detlef Schuppan  

Özet

Buğday, proteinleri insan ve hayvan beslenmesine katkıda bulunduğu ve son kullanım kalitesi için önemli olduğundan dolayı kilit öneme sahip bir üründür. Bununla birlikte, buğday proteinleri çok sayıda insan için olumsuz tepkilere de neden olabilir. LC-MS tabanlı proteomiks ile ölçülen ve 148 buğday çeşidinde çevresel olarak kararlı bir şekilde ifade edilen ve kalıtım derecesi > 0,6 olan 114 protein üzerinde genom çapında bir ilişkilendirme çalışması (GWAS) gerçekleştirdik. 54 protein için Bonferroni düzeltmeli anlamlılık eşiğini aşan ve genotipik varyansın %17,3-84,5’ini açıklayan kantitatif özellik lokusları (QTL) tespit ettik. Aynı ailedeki proteinler genellikle çok yakın bir kromozomal konumda veya potansiyel homeologda kümelenmiştir. İyi bilinen dört glutenin ve gliadin alt birimi için başlıca QTL’ler bulunmuş ve yüksek moleküler ağırlıklı glutenin alt birimi Dx5’i kodlayan proteindeki QTL ayrım modeli SDS jel-elektroforezi ile doğrulanabilmiştir. Dokuz potansiyel alerjenik protein için büyük QTL’ler tanımlanabilmiş ve ölçülen alel frekansları, insan sağlığıyla ilgileri kesin olarak gösterildiği sürece markörlerle düşük protein bolluğu için seçim yapma olasılığını ortaya çıkarmıştır. 1980’lerin başında, Triticum ventricosum’dan kromozom 2AS üzerine aktarılan direnç genleri kümesiyle bağlantılı olabilecek potansiyel bir alerjen ortaya çıkmıştır. Rapor edilen 54 ana QTL için dizi bilgileri, gelecekteki buğday ıslahı için etkili belirteçler tasarlamak için kullanılabilir.

Giriş

Buğday (Triticum aestivum ssp. aestivum) dünya çapında en yaygın olarak yetiştirilen üründür ve insan beslenmesinin önemli bir bileşenidir. Bu temel ürün en önemli enerji kaynaklarından biridir ve ortalama olarak insan beslenmesindeki toplam protein ve kalorinin %20’sini sağlar. Buğday birçok farklı biçimde tüketilir ve her bir son ürün türü, esas olarak glüten miktarı ve bileşiminden etkilenen hamurun viskoelastik özelliklerine dayalı belirli bir kalite gerektirir. Gluten, tahıldaki toplam proteinin yaklaşık %80’ini oluşturur ve gliadinler ve gluteninler olarak ikiye ayrılabilir. Gluteninler, sırasıyla Glu-1 ve Glu-3 lokusları tarafından kodlanan yüksek ve düşük moleküler ağırlıklı alt birimler (HMW-GS ve LMW-GS) olarak sınıflandırılır. Glutenin alt birimlerindeki alel çiftleri arasındaki farklılıklar son kullanım kalitesi üzerinde güçlü bir etkiye sahiptir. Örneğin, birçok çalışma Dx5 + Dy10 (Glu-D1d) alellerinin yüksek kalite ile ilişkili olduğunu, Dx2 + Dy12’nin (Glu-D1a) ise düşük kaliteye yol açtığını göstermiştir. Sonuç olarak, Payne ve arkadaşlarının öncü çalışmasından bu yana buğday ıslahçıları yoğun bir şekilde belirli HMW-GS kombinasyonlarını seçmiştir. Son ürün kalitesi üzerindeki etkisine ek olarak, gluten ve buğday amilaz tripsin inhibitörleri (ATI’ler) gibi gluten olmayan proteinler de çölyak hastalığı, alerjik reaksiyonlar ve çölyak dışı buğday hassasiyeti gibi çeşitli insan sağlığı bozukluklarıyla ilişkilidir. Bununla birlikte, buğday alerjenlerini hedeflemek, son ürün kalitesi üzerindeki etkisi nedeniyle gluten kalitesini iyileştirmek dışında hiçbir zaman ıslah programlarının bir hedefi olmamıştır. Örneğin, son yüzyılda piyasaya sürülen buğday çeşitlerinde birçok alerjenik proteinin veya ATI’nin bolluğu değişmemiştir. Son yıllarda sadece birkaç protein ayrıntılı olarak araştırılmış olsa da, kütle spektrometresi tabanlı proteomik alanındaki son gelişmeler, tek bir örnekte yüzlerce proteinin belirlenmesine olanak sağlamıştır. Afzal ve arkadaşları, üç farklı bölgede yetiştirilen 15 kavuzlu buğday ve buğday çeşidinin un proteomunu analiz etmiş ve orta ila yüksek kalıtsallığa (>0,4) sahip 300 protein de dahil olmak üzere 3050 protein tanımlamıştır. Ancak, bildiğimiz kadarıyla, şimdiye kadar modern proteomik araçlarla keşfedilen çok sayıda proteinin genetik mimarisini araştıran bir çalışma yapılmamıştır.

Şekil 1. Manhattan grafiği, 54 proteinin tamamı için önemli işaretleyici-özellik ilişkilerini gösteriyor; burada Bonferroni tarafından düzeltilmiş p < 0.05 anlamlılık eşiğindeki QTL’ler tanımlandı (kırmızı çizgi).

Bu nedenle, üç ortamda yetiştirilen 148 ekmeklik buğday çeşidinden sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) tabanlı etiketsiz kantitatif (LFQ) proteomik kullanılarak ölçülen 114 proteinin genetik mimarisini araştırmak için bir GWAS gerçekleştirdik. Ayrıca, ilgili proteinlerle ilişkili bazı önemli QTL’lerin alellerinin genetik ve zamansal eğilimi araştırılmış ve ilgili QTL’ler için sekans bilgileri sağlanmıştır, böylece moleküler belirteçlerin tasarlanması mümkün olmuştur.

Sonuçlar

Önceki bir çalışmada, üç ortamda yetiştirilen 148 buğday çeşidinin tam tahıllı unundan elde edilen sulu ekstraktlarda 756 protein ölçtük. Bu 756 proteinden sadece 114’ü, 0,6’dan daha büyük bir kalıtımsallığa sahip çoğu buğday çeşidinde ortamlar arasında istikrarlı bir ifadeye sahipti. Bu 114 protein için bir GWAS gerçekleştirdik ve Bonferroni düzeltmeli anlamlılık eşiğini aşan 54 protein için QTL’ler tespit ettik (Şekil 1 ve Şekil 2). Tüm bu 54 protein için, genotipik varyansın %17,3 ila %84,5’ini açıklayan tek bir ana QTL tanımlanmıştır (Şekil 2b, Tablo 1). Tanımlanan QTL’ler 24 protein için genotipik varyansın >%50’sini açıklamıştır (Şekil 2b). Buna karşılık, 60 protein için Bonferroni düzeltmeli anlamlılık eşiğini aşan hiçbir belirteç-özellik ilişkisi tespit edilmemiştir.

Şekil 2. (a) 54 ana QTL'nin farklı kromozomlar üzerindeki dağılımını gösteren pasta grafik; (b) 54 QTL tarafından açıklanan genotipik varyans oranının sıklığı.

Başlıca QTL’ler birçok kromozoma dağılmış ve kısmen benzer kromozomal bölgelerde kümelenmiştir (Şekil 2 ve Şekil 3). QTL’ler A ve B genomlarında nispeten benzer bir dağılımla 1A, 2A, 4A, 5A, 7A, 1B, 3B, 4B, 5B, 6B, 7B, 1D, 4D, 6D ve 7D kromozomlarında tanımlanırken, tanımlanan QTL’lerin yalnızca %12’si D genomunda yer almıştır. Daha fazla sayıda proteinin 1A, 2A, 1B ve 3B kromozomları üzerindeki başlıca QTL’lerden etkilendiği görülmüştür. İlginç bir şekilde, farklı proteinler için bazı QTL’ler neredeyse aynı genomik konumda tanımlanmıştır (Şekil 3). Örneğin, kromozom 5A üzerinde, UniProt veri tabanına göre her ikisi de ß-amilaz olan prot085 ve prot141 için QTL’ler aynı kromozomal ve fiziksel konuma sahipti. Benzer şekilde, prot171 ve prot179 için QTL’ler kromozom 3B üzerinde aynı fiziksel konuma sahipti, ancak mevcut çeşitli protein ek açıklama veri tabanlarına göre, bu proteinlerin aynı aileye ait olup olmadığı henüz net değildir. Islah için kullanımı kolay belirteçler tasarlamak amacıyla, tanımlanan tüm 54 QTL’nin SNP, genomik konum ve dizi bilgilerini özetledik.

Tablo 1. Bu çalışmada tanımlanan iki gluten proteini, dört gluten dışı alerjenik protein ve Allergome veri tabanında alerjen olarak da listelenen beş gluten proteinini kontrol eden QTL’ler (HMW = Yüksek moleküler ağırlık; LMW = Düşük moleküler ağırlık; LTP = Lipid transfer proteini).

Bu on bir proteinle ilişkili QTL’lerin alel frekanslarını da araştırdık (Şekil 4). prot008, prot017, prot066 ve prot235 için QTL’lerinin alel frekansları yaklaşık 0,5 olarak bulunmuştur. Buna karşılık, diğer yedi proteinin QTL’leri için alel frekansları, bir alelin oldukça yüksek frekansına eğilim göstermiştir. İlginç bir şekilde, bu yedi proteinden beşi için, protein bolluğunu artıran QTL alelleri daha sıktı. Bu çalışmada kullanılan buğday çeşitleri geçen yüzyılın farklı on yıllarında piyasaya sürüldüğünden, buğday yetiştiricileri tarafından potansiyel seçim eğilimlerini görselleştirmek için bunları buna göre gruplandırdık. Dört protein için, QTL alel frekanslarında on yıllar boyunca değişimler gözlemledik.

Son olarak, 11 proteinin QTL’lerini barındıran kromozomal bölgeleri ayrıntılı olarak araştırdık. Bu bölgeler için, ekmeklik buğday referans genomundan (IWGSC RefSeq v2.1) yüksek güvenirlikli (HC) genler çıkardık ve bunları Pfam ve InterPro veri tabanlarında gluten ve alerjenik proteinlerin farklı alanlarına benzer fonksiyonel ek açıklamalara sahip potansiyel aday genler olarak değerlendirdik. Gluten proteinleri (prot051 ve prot104), alerjenler ve gluten (prot017, prot028, prot139 ve prot203) ve gluten dışı alerjenler (prot189, prot235) ile ilişkili QTL hedef bölgelerinde sırasıyla sekiz, beş ve yirmi iki potansiyel aday gen tanımlanmıştır. Prot066, prot008 ve prot288 için tespit edilen QTL’ler için hiçbir potansiyel aday gen tanımlanamamıştır.

Toplam 54 Protein için Belirlenen Başlıca QTL’ler

İstatistiksel olarak muhafazakar Bonferroni düzeltmeli anlamlılık eşiği kullanarak bir GWAS uygulayarak, 114 proteinden 54’ü için ana QTL’leri belirledik (Şekil 1 ve Şekil 2). Bulgularımız, incelenen proteinlerin yarısından fazlasının kantitatif olarak kalıtıldığını ve her biri oldukça küçük etkiye sahip birçok gen tarafından kontrol edildiğini göstermektedir. Bu kantitatif kalıtım, verim gibi en çok araştırılan özelliklerin yanı sıra klasik olarak belirlenen protein içeriği için de literatürde iyi tanımlanmıştır. Buna karşılık, 54 protein için tanımlanan QTL’lerin çoğu Manhattan grafiğinde çok yüksek tepe noktalarına sahipti (Şekil 1) ve bireysel proteinlerin genotipik varyansının büyük bir kısmını açıklıyordu (Şekil 2b, Tablo 1). Buğdayda, bitki boyu (Rht genleri), başaklanma zamanı (Ppd genleri) ve hastalık direnci (örneğin, Lr genleri) gibi önemli QTL’ler bilinmektedir, ancak çoğu durumda, açıklanan genotipik varyansın oranı çalışmamızdaki birçok proteinden çok daha düşüktür. Bu nedenle, belirlenen QTL’ler, ilgili proteinlerin gelecekteki buğday tedarik zincirleri için uygunluğunun gösterilmesi koşuluyla, gelecekteki buğday ıslahı için çok ilginç olabilir.

Şekil 3. İlgili protein adı ve fiziksel konumu (Mbp) ile 54 QTL'nin dağılımını gösteren kromozom haritası. Buğday unu proteinlerinin detaylı bir incelemesi için UniProt ve InterPro veri tabanlarına dayalı olarak gluten ve potansiyel alerjenite ile ilişkili on bir proteine odaklandık (Tablo 1). Yedi gluten proteininden beşi Allergome veritabanında da mevcuttu. Bu on bir proteini şu gruplara atadık: glüten, glüten ve alerjen ve glüten olmayan alerjen. UniProt veri tabanını kullanarak, HMW-GS Dx5 ve LMW Glu-A3 gibi pişirme kalitesi için önemli proteinler de dahil olmak üzere bu on bir proteinden sekizini adlandırabildik. İki lipid transfer proteini için QTL’ler tanımlanabildi, ancak ATI’ler veya serpinler gibi bilinen diğer potansiyel alerjenik buğday proteinleri için tanımlanamadı.

Tanımlanan 54 QTL, A ve B genomları arasında benzer şekilde dağılmış, ancak D genomunda sadece az sayıda QTL tespit edilmiştir (Şekil 2a ve Şekil 3). Bu durum buğdayda genomik literatürle uyumludur ve D genomunun A ve B genomlarına kıyasla sınırlı genetik çeşitliliği ile açıklanabilir. Buğdayın D genomunun genetik potansiyelini kullanmak için sentetik buğday gibi ilginç ıslah yaklaşımları kullanılmaya başlanmıştır. Bu ıslah türleri oldukça yeni olduğundan ve bildiğimiz kadarıyla Avrupa buğday çeşitlerinde henüz mevcut olmadığından, buğday çeşitleri listemizde de yer almamaktadır.

Aynı aileye ait proteinler için, fiziksel konumları aynı kromozom üzerinde birbirine yakın olan lokuslar veya potansiyel homolog kromozomlar üzerindeki lokuslar tarafından kontrol edildiklerini bulduk (Şekil 3). Örneğin, hepsi 4A ve 4B kromozomları üzerinde bulunan altı Cupin 1 proteini için QTL’ler belirledik (Şekil 3, Tablo 1). Proteinler 045 ve 092’nin QTL’leri 4A’da aynı fiziksel harita konumunda bulunurken, proteinler 040, 054 ve 120’nin QTL’leri 4B’de birbirine çok yakındı. Diğer protein aileleri için başka QTL kümeleri bulduk. Bu QTL’ler 2A üzerinde üç geç embriyogenez bol proteini, 1B üzerinde aldo/keto redüktaz ailesinin iki proteini, 5A üzerinde iki β-amilaz ve 7B üzerinde kitinaz sınıf 1’in iki proteini için bulunur. Potansiyel olarak homolog kromozomal pozisyonlar 5A ve 5B’de iki lipit transfer proteini, 6B ve 6D’de iki bitki antimikrobiyal proteini, 7A ve 7B’de üç kitinaz sınıfı 1 proteini ve 1A ve 1B’de iki LMW-GS için QTL’ler için tanımlanmıştır (Şekil 3, Tablo 1). Bu bulgular, önemli gen ailelerinin aynı homolog kromozom grubu üzerinde yer aldığı diğer özelliklerle karşılaştırılabilir; örneğin, grup 4 kromozomları üzerinde bitki boyu (Rht1 ve Rht2 genleri) veya grup 2 kromozomları üzerinde başaklanma zamanı (Ppd-1 genleri). Özet olarak, bildiğimiz kadarıyla, buğday proteomu üzerine yapılan bu en büyük GWAS çalışması, 114 proteinden 24’ü için ana QTL’ler ile diğer özellikler için bildirilen proteinlerin benzer bir genetik mimarisini ortaya koymuştur.

Önemli Gluten Proteinleri için QTL'ler

Yüksek ve düşük moleküler ağırlıklı gluteninler buğdayın son kullanım kalitesi için büyük önem taşımaktadır. Payne ve meslektaşlarının öncü çalışmalarından bu yana buğday ıslahında yoğun araştırma ve kullanım altındadırlar. Özellikle gluteninler, bir HMW- ve iki LMW-GS proteinleri ile ilgili üç proteini destekleyen üç ana QTL belirledik (Tablo 1). Kromozom 1D üzerinde, Uniprot veri tabanına göre HMW-Dx5 olarak açıklanan prot017 için genotipik varyansın %42,7’sini açıklayan büyük bir QTL bulduk (Tablo 1). Buğday çeşitlerimiz üzerinde SDS-PAGE ile yapılan elektroforetik analiz, prot017’nin QTL aleli GG’nin HMW bantlama birimi 5 ile ve QTL aleli AA’nın HMW bantlama birimi 2 ile 148 buğday çeşidinin toplam 143’ünde temsil edildiğini ortaya koyarak Uniprot ek açıklamasını doğrulamıştır. İlginç bir şekilde, SDS bantlama modelindeki allelik farklılık, Dx5 (GG) birimine sahip çeşitlerin Dx2 (AA) birimine sahip çeşitlerden daha düşük bir bolluğa sahip olduğu tek bir proteinin (017) kantitatif ölçümlerinden çıkarılabilir (Şekil 4). Kütle spektrometresi tabanlı proteomik iş akışımızla ölçülen triptik peptitlerle oldukça homolog protein izoformlarını niteliksel olarak ayırt etmek mümkün olmasa da, gen ürününün görünüşte alele bağlı ifade seviyesi, tamamlayıcı SDS-PAGE yaklaşımı ile mükemmel bir şekilde yakalanmıştır. Bu vaka çalışması, kantitatif protein ölçümlerinin ıslah çalışmaları için tamamen genetik analizlere ek ilgili bilgi içeriği sağlayabileceğini vurgulamaktadır.

Düşük Alerjen İçeriği için Yetiştirme İmkanı

Buğday önemli ve çoğunlukla sağlıklı bir temel ürün olmasına rağmen, önemli sayıda insan buğday hassasiyetinden muzdariptir ve potansiyel tetikleyicilerin çoğu proteindir. Zimmermann ve arkadaşları ile Afzal ve arkadaşlarının yaklaşımını izledik ve tohum kaynaklı buğday alerjenleri ve Allergome veri tabanı verilerine dayanarak bir alerjen listesi derledik. Bu listeden dokuz protein için, çalışmamızda ilgili proteinin genotipik varyansının %32,3 ila %84,5’ini açıklayan önemli QTL’ler tespit ettik (Tablo 1). Bunlardan beşi gluten proteinleri, ikisi olası lipid transfer proteinleri, biri peroksiredoksin ve biri de potansiyel bir proteaz inhibitörüydü (Tablo S1). Bu dokuz proteinden üçü için, geçmiş on yıllara ait buğday çeşitlerindeki başlıca QTL’lerde bir seçilim eğilimi gözlemleyebildik (Şekil 4). Yüksek protein bolluğu üreten markör aleli bir proteaz inhibitörü olan prot288 için artarken, düşük protein bolluğundan sorumlu markör aleli prot017, HMW-Dx5 ve prot203, LMW-GS Glu-A3 için artmıştır. Son ikisi, daha önce tartışıldığı gibi, bitki ıslahçılarının yoğun bir şekilde seçtiği önemli buğday kalitesi proteinleridir ve aynı zamanda az sayıda insan için potansiyel alerjenler olarak görünmektedir. İlginç bir şekilde, bu iki lokustaki daha iyi pişirme kalitesi, daha düşük protein bolluğu, yani daha düşük alerjen seviyeleri ile ilişkili görünmektedir.

Prot288 için seleksiyon eğilimi, protein bolluğunu artıran QTL alelinin 1980’lerin başında introdüksiyonu ve ardından buğday ıslahçıları tarafından frekansının istikrarlı bir şekilde artırılması açısından ilginçtir. Potansiyel olarak alerjenik proteinler için veya bunlara karşı seleksiyon, buğday ıslahında hiçbir zaman bir hedef olmamıştır. Bu nedenle, bu seçim eğilimi, buğday ıslahında 1980’lerden beri kullanılan ve büyük ölçüde kromozom 2A’nın kısa kolundaki genomik bölgeden etkilenen başka bir hedef özellik ile bağlantıdan kaynaklanıyor olabilir. Bu kromozomal bölge, Triticum ventricosum’dan kabaca karşılaştırılabilir bir geçmişe sahip olan bir introgression içerir. Bu introdüksiyon, çeşitli önemli pas hastalıklarına karşı birkaç önemli hastalık direnç genini (örneğin, Lr37 ve Sr38-Yr17-Lr34) taşır. Buna ek olarak, bu gen aktarımının verim istikrarını ve pirinç patlamasına karşı direnci de artırdığı görülmektedir ki bu özelliklerin tümü dünya çapındaki birçok buğday ıslah programı için büyük önem taşımaktadır. Buğday çeşitlerimizin büyük bir kısmı için, prot288’in farklı QTL alelleri ile neredeyse mükemmel bir şekilde eşleşen Sr38-Yr17-Lr34 hastalık direnci kümesi için moleküler markör bilgileri mevcuttur. Sonuç olarak, potansiyel alerjen prot288’in bolluğunu artıran QTL alelindeki artış, yakındaki hastalığa direnç genlerinin dolaylı seçiliminden kaynaklanıyor olabilir. Fiziksel konumlara göre, tanımladığımız QTL, hastalık direnci kümesi için bildirilen lokustan 6 Mbp uzaktadır. Gelecekteki çalışmalar, bu potansiyel bağlantının her iki lokus için de belirteçler kullanılarak hedefli seleksiyonla kırılıp kırılamayacağını göstermelidir.

Altı potansiyel alerjenik proteinin QTL’leri için, buğday ıslahının onlarca yılı boyunca net seçim eğilimleri tespit etmedik, ancak ya yüksek protein bolluğuna (prot139, prot189) neden olan QTL alelinde neredeyse bir sabitleme ya da her iki alelin benzer frekanslarını tespit ettik. Bu durum, sekiz ATI’nin mutlak protein miktarlarını izotopik olarak etiketlenmiş standart peptitlerle ölçtüğümüz tamamlayıcı çalışmamızla doğrulanmıştır. Burada, monomerik ATI 0.28 için benzer alel frekanslarına sahip monomerik ve dimerik ATI’ler için ana QTL’ler tanımlanmıştır, ancak dimerik ATI 0.19 benzeri yüksek protein bolluğundan sorumlu QTL alelinin sabitlenmesine yakındır. Sonuç olarak, her iki çalışmada da tanımlanan başlıca QTL’ler için bildirilen dizi bilgileri, potansiyel olarak alerjenik on bir proteinin düşük protein bolluğu için ıslahı büyük ölçüde kolaylaştırabilir. Bu nedenle, bu proteinlerin bolluğunu azaltmanın insan ve hayvan sağlığı açısından uygunluğunu belirlemek için daha fazla çalışmaya acilen ihtiyaç vardır, böylece bu ek özellikler için zahmetli ıslah ilerlemesi nihayet ele alınabilir.