1. Giriş 

Bir buğday tanesinin kepek ve tohum fraksiyonlarında bulunan çok sayıda enzim, tam buğday ununun bileşimsel ve fonksiyonel özelliklerini etkileyen birçok kimyasal değişikliği başlatır. Genel olarak, buğday unu başlıca nişasta, su, proteinler gibi makrobesinler ve lipidler ve küller gibi nişasta olmayan polisakkaritlerden oluşur ve ayrıca başlıca amilazlar, proteazlar, lipoksijenaz, polifenol oksidaz gibi teknolojik olarak önemli birkaç enzim içerir. ve peroksidaz. Ek olarak, pişirme işlemiyle ilgili en önemli üç enzim grubu vardır: Selülaz, amilaz ve pentosanazlar gibi karbonhidratları hidrolize eden enzimler, proteazlar gibi proteinleri hidrolize eden enzimler ve katı ve sıvı yağları etkileyen enzimler. , esas olarak lipaz ve lipoksijenazlar. Enzimler tahıl ve unun depolanması sırasında inaktif olmalarına rağmen su ilave edildiğinde aktif hale gelirler ve bu nedenle unun fonksiyonel özelliklerinin belirlenmesinde önemli rol oynarlar.

Gıda endüstrisinin karşılaştığı zorluklardan biri, tam buğday ununun depolama sırasındaki kararlılığıdır. Depolama sırasında hidrolitik ve oksidatif acılaşmanın gelişmesi, unun bileşimsel ve fonksiyonel özelliklerinin yanı sıra duyusal kabul edilebilirliği de azaltır. Bu nedenlerle, ürün geliştirme ve formülasyonlarda kullanılacak tam buğday ununun kalitesini korumak, değirmencilik şirketleri ve gıda endüstrisi için zorlu bir iştir. Depolama sırasında unda serbest yağ asitlerinin birikmesi, unun ilk lipaz aktivitesi ile pozitif ilişkilidir. Lipaz aktivitesinin azaltılması/inaktive edilmesi, serbest yağ asitlerinin birikimini azaltmak için yöntemlerden biri olacaktır. Diğer bir enzim sınıfı olan oksidoredüktaz enzimleri olan peroksidazlar, oksidan olarak hidrojen peroksit veya organik hidroperoksitler kullanır. Peroksidaz ayrıca hamur karıştırma sırasında karotenoid ağartmada önemli bir rol oynar ve unun istenmeyen esmerleşmesinden sorumlu olabilir.

Önceki çalışmalar, enzim aktivitesini azaltmak için buharlama, mikrodalga ısıtma ve kızılötesi ve gama radyasyonundan geçme gibi farklı ısıl işlem yöntemlerini kullanmıştır. Bu yöntemlerin dezavantajı, yüksek enerji tüketiminin yanı sıra gıda ürününün kalitesini de etkileyen yüksek sıcaklıkların kullanılmasıdır. Konvansiyonel ısıl işlem uygulamaları besin kayıplarına ve duyusal kalitelerde istenmeyen değişikliklere neden olmaktadır. Ayrıca, buğday unundaki aşırı yüksek bir proteaz konsantrasyonu, glüten protein yapısının tamamen bozulmasına neden olabilir ve nişastayı parçalamak için az miktarda a-amilaz enzimi gereklidir, bu da daha sonra yeterli miktarda fermente edilebilir şeker sağlar. Bu genellikle, mantar veya bakteriyel a-amilazın malt veya ticari preparatlarının eklenmesiyle sağlanır. Bununla birlikte, fazla enzim varsa, nişasta dekstrinlere ve basit şekerlere parçalanır, bu da ıslak, yapışkan bir kırıntıya sahip ekmek üreten yapışkan, işlenmesi zor bir hamurla sonuçlanır.

Bu makale, farklı uygulamalar için farklı un türlerinin enzim aktivitelerine ve bileşim özelliklerine odaklanmaktadır. Çeşitli un türlerinde protein konsantrasyonlarındaki farklılıkları tanımlamak için protein ekstraksiyon işleminin optimizasyonu yapıldı. Ayrıca, bu çalışmanın bir başka amacı, CO2 düşük reaktiviteye sahip termodinamik olarak kararlı bir molekül olduğundan, scCO2 işleminin tam buğday ununun bileşimsel ve fonksiyonel özellikleri üzerindeki etkilerini gözlemlemekti . Prensip olarak, yeşil, susuz, daha enerji verimli, daha temiz ve daha güvenli bir üretim yöntemi olarak scCO2 arıtma teknolojisi, son yıllarda farklı endüstrilerde büyük ilgi görmüştür. scCO2 yaygın olarak kullanılmaktadır ve toksik olmaması ve orta derecede kritik özellikleri (kritik basınç: 7,38 MPa, kritik sıcaklık: 304,35 K) nedeniyle gıda, kozmetik ve ilaç endüstrileri için tercih edilen solvent haline gelmiştir. En yaygın olarak kullanılan süperkritik akışkan olan scCO2'de enzim aktivitesinin farklı basınç/sıcaklık/zaman kombinasyonları ile ayarlanabileceği ve belirli koşullarda azaltılabileceği iyi bilinmektedir. Bu, su ve karbamatların varlığında enzim üzerindeki amin gruplarıyla reaksiyona girerek karbonik asit oluşumuna bağlanabilir. Belirli basınç ve sıcaklık koşulları altında, katalitik merkezin gömülmesine yol açan β-yaprak yapısındaki bir artışla protein yapısında bir değişiklik meydana gelebilir. Daha sonra, unun scCO2 işlemi, ısıl işlem olmaksızın enzimatik aktiviteleri verimli bir şekilde azaltabilir ve bu işlem bittikten sonra aynı kalitede unun elde edilmesini sağlayabilir. Bazı enzimlerin istenmeyen etkilerinden dolayı buğday ununda bu enzimlerin inaktivasyonunu sağlamak için bir dizi deney yapılmıştır.

Kesinlikle, ekmek hamuru modellemesinin fermantasyonunu anlamak için gerekli olan scCO2'nin çözünürlüğü önemli bir parametredir. Fan ve ark. Pişirme sırasında sulu hamurda CO2 çözünürlüğünü araştırdı ve buharın sonraki genişlemeye önemli bir katkı sağladığı için, hamurun fırında erken kabarmasından CO2 çözünürlüğünün sorumlu olduğunu buldu. Bu nedenle CO2'nin çözünürlükleri de farklı un çeşitlerinde ölçülmüştür.

Ayrıca beyaz buğday unu, undaki enzimleri inaktive etmek amacıyla scCO2'ye maruz bırakıldı. Böylece, unun scCO2'ye maruz bırakılmasından sonra proteinler ekstrakte edildi ve süpernatanda a-amilaz, lipaz, proteaz ve peroksidaz enzimlerinin kalıntı aktiviteleri belirlendi. Ayrıca, maruz kalmayan undaki enzim aktivitesi ile scCO2 ile muamele edilmiş unda kalan enzim aktivitesi ile scCO2 ile muamele edilen serbest enzimlerin aktiviteleri arasında bir karşılaştırma yapılmıştır. scCO2 kullanarak enzim inaktivasyonunun mekanizmasını anlamak için amino asitler, proteinler ve CO gibi biyolojik moleküller arasındaki etkileşimleri bilmek önemlidir. Amino asitler, amin (NH2) ve karboksil (COOH) fonksiyonel grupları içeren proteinlerin yapısal bileşenleridir. her amino aside özgü bir yan zincire (R grubu - alifatik, asiklik, aromatik) sahiptir. Ayrıca, dipol-dört kutuplu etkileşimlerin bu tür karmaşık termodinamik sistemlerin (su + amino asit + karbon dioksit) araştırılmasında önemli hale geldiği CO2'yi yakalamada amino asitlerin ve amino asit tuzlarının sulu bir çözeltisi avantajlıdır. scCO2'ye maruz kalan amino asitlerdeki temel kimyasal modifikasyonlar oksidasyon, sülfonasyon, hidroksilasyon, halka açılması ve amidasyondur. Bu çalışmadan elde edilen bilgi, gıda endüstrisinde ve gıda biliminde scCO2 kullanımına yönelik sürdürülebilir bir yaklaşımın uygulanmasını teşvik etmeye de yardımcı olabilir.

2. Malzemeler ve Yöntemler

Beyaz buğday unu tip 500, buğday unu tip 850, çavdar unu tip 1250, tam tahıllı çavdar unu, graham unu ve kepekli buğday unu Hlebček, d.o.o. (Pragersko, Slovenya). Deneyler, Messer, Ruše tarafından üretilen karbon dioksit (%99,5 saflık) kullanılarak yapıldı. Etanol (%96), fosforik asit (≥%85), sodyum klorür (≥%99,5), Coomassie-Brilliant Blue G250 (1.15444.0025) ve asetonitril (%99.9) Merck'ten, sığır serum albümini (≥ %96), sodyum asetat (≥99.0%), asetik asit (analiz için GR), p-nitrofenil butirat (≥ %98) Sigma'dan sağlandı. Aspergillus oryzae'den a-amilaz (~30 U/mg) ve Aspergillus saitoi'den proteaz (≥0,6 U/mg) enzimleri BioChemics'ten elde edilmiştir. Horseradish'ten (232-668-6) peroksidaz, BBI Enzymes'ten (İngiltere) satın alındı. Lipid ekstraksiyonu için kullanılan petrol eteri (32247), Honeywell, Riedel-de Haen tarafından sağlandı. Laboratuvarda kullanılan diğer tüm kimyasallar analitik saflıktaydı.

2.1. Protein Ekstraksiyon Süreci

Proteinlerin ekstraksiyonu, bir Erlenmeyer şişesi içinde 5 g buğday unu ile pH 5.3 olan 0.1 M asetat tamponu içinde gerçekleştirildi, ardından 300 rpm'de yatay çalkalama ile oda sıcaklığında belirli bir süre inkübe edildi. Daha sonra 8000 rpm'de beş dakika santrifüj işlemi gerçekleştirildi. Ekstraksiyon sürecini optimize etmek için, en yüksek protein konsantrasyonu değerini elde etmek için üç farklı santrifüjleme ve filtrasyon kombinasyonu gerçekleştirilmiştir. Böylece ilk numune, 0.45 um'lik bir gözenek boyutuna sahip bir filtreden süzüldü. İkinci numune için, aynı koşullar altında (8000 rpm, beş dakika) ek santrifüj gerçekleştirildi. Üçüncü örnekte, birinci santrifüjlemeden sonra süpernatant dökülmüştür. Her üç kombinasyon için de süpernatan ayrıldı ve ham protein özütü olarak kabul edildi. Protein konsantrasyonu, süpernatanda Bradford yöntemine göre belirlendi. Her numune iki kez test edildi ve ekstrakte edilen numune başına üç ayrı absorbans ölçümü, yaklaşık %0.03'lük bir deneysel hata içinde kaydedildi.

2.2. scCO2 Orta Arıtma 

scCO2'nin enzimlerin aktiviteleri üzerindeki etkilerini belirlemek için bir scCO2 teknolojisi uygulaması uygulandı. İlk olarak, doğal enzimler, yüksek basınçlı bir kesikli reaktörde farklı koşullar altında scCO2'ye maruz bırakıldı ve ardından beyaz buğday unu, aynı koşullar altında scCO2 ortamına maruz bırakıldı. Deneysel araştırmada CO2 gaz beslemeli 60 mL hacimli yüksek basınçlı kesikli reaktör kullanılmıştır. Yüksek basınçlı kesikli reaktördeki sıcaklık 35 °C'ye ulaştığında, soğutulmuş CO2 ile basınç istenen 200 ve 300 bar değerine yükseltildi.

2.3. Un Fizikokimyasal Analizleri

2.3.1. Nem İçeriği: Nem, 130 °C'ye ısıtılarak kurutulan bir numunenin ağırlık kaybından belirlendi. Yaklaşık %0.5'lik bir deneysel hata içinde güvenilir sonuçlar elde etmek için un numunelerinde nem tayini üç kez tekrarlandı.

2.3.2. Parçacık Boyutu Analizi: Önceki çalışmalar, tüm buğday türlerinden elde edilen unların parçacık boyutu dağılımının, elek analizinden ziyade lazer kırınımı ile daha hassas bir şekilde ölçülebileceğini göstermiştir [24].

2.3.3. Çevresel Taramalı Elektron Mikroskobu: scCO2 yüksek basınç işlemi ESEM sırasında undaki nişasta granüllerinde meydana gelen morfolojik değişiklikleri gözlemlemek için çevresel modda bir Quanta FEI 200 3D, Oregon, Amerika Birleşik Devletleri mikroskobu kullanıldı. Basınç odası 60 Pa ve görüntüleme için hızlanan voltaj 10 kV idi.

2.3.4. Manyetik Süspansiyon Dengesi (MSB) ile Unda CO2 Çözünürlüğünün Belirlenmesi: Faz dengesi davranışı, CO2'nin çözünürlüğünün ve CO2 ile doyurulmuş unun hacimsel genişlemesinin belirlenmesiyle incelenmiştir. CO2'nin çözünürlüğü, çözeltide çözülebilen karbonat türlerinin toplam miktarıdır. CO2'nin farklı un türlerindeki çözünürlükleri, 1 ila 350 bar arasında değişen basınçlarda manyetik süspansiyon terazisi (MSB, RUBOTHERM, Berlin, Almanya) içeren gravimetrik bir yöntemle ölçülmüştür (Şekil 1). Uygulanan MSB, maksimum 350 bar çalışma basıncı ve 562 K çalışma sıcaklığı için tasarlanmıştır. Hücrenin sıcaklığı, bir Lauda P5 termostatı (Lauda, Königshofen, Almanya) kullanılarak sabit tutulmuştur. MSB'nin ölçüm hücresi, sorpsiyon ölçümleri sırasında numunenin gözlemlenmesine ve hacim değişikliklerinin tahmin edilmesine izin veren bir safir pencereye sahiptir. MessPro yazılımı (SL-2500-00216, Ver.11.05) koşulları (kütle, sıcaklık, basınç) kaydetti. Bu süreden sonra dengeye ulaşıldığı için her bir basınçta ölçüm süresi yaklaşık 120 dakika idi. Numunenin hacmini belirlemek için dijital kamera ile numunenin fotoğrafı çekildi ve ImageJ 1.52 yazılımı (Freeware) kullanılarak analiz edildi.

2.3.5. Fourier Dönüşümü Kızılötesi Spektroskopisi: İşlem görmemiş un ve un numuneleri için hızlı ve yavaş genişlemeli scCO2 ortamı işleminden sonra bir ATR aksesuarı kullanılarak Fourier dönüşümü kızılötesi spektroskopisi (FTIR, IRaffinity-1s, Shimadzu, Slovenya) yapıldı. Fonksiyonel gruplardaki değişiklikleri kalitatif olarak gözlemlemek ve scCO2 işleminin etkisiyle nişasta granüllerinin bileşenlerindeki değişiklikleri daha da değerlendirmek için FTIR analizi yapıldı.

2.3.6. Undaki Toplam Lipidlerin Belirlenmesi: Lipidler, organik çözücülerde çözünen bir grup maddedir [25]. Genel olarak, Soxhlet ekstraksiyonu, kurutulmuş gıdalardaki toplam lipidlerin belirlenmesi için en yaygın olarak kullanılan yöntemlerden biridir. Bu nedenle, işlenmemiş ve scCO2 ile işlenmiş un numunelerinden lipidleri petrol eterine çıkarmak için bir Soxhlet cihazı kullanıldı. Lipitleri 180 mL petrol eteri ile çıkarmak için toplam 10 g un numunesi kullanıldı, 60 °C'de 5 saat kaynatıldı. Soxhlet ekstraksiyonunda, solvent, ekstraksiyon odasında (un numunesi bir filtre kağıdı yüksüğünde tutuldu) 5-10 dakika biriktirildi ve daha sonra kaynama şişesine geri döndü. Bu yöntem numune için bir ıslatma etkisi sağlar. Çözünmüş lipitlerin bulunduğu yuvarlak dipli şişedeki çözücü belirli bir süre sonra çıkarıldı ve lipitlerin çözeltiden geri kazanılması için kullanılan 40 °C'de bir rotavapor cihazı kullanılarak organik çözücü buharlaştırılarak lipitler izole edildi. kurumaya yakın. Elde edilen ekstrakte edilmiş lipidlerin kütlesi, ekstraksiyon verimi hesaplanarak belirlendi.

Ayrıca numunedeki lipid içeriğinin yüzdesi Denklem (1) kullanılarak hesaplanmıştır.

Burada M extract, petrol eteri buharlaştırıldıktan sonra tartılan lipitlerin kütlesidir ve M un numunesi, lipit ekstraksiyonu için kullanılan un kütlesidir.

2.4. Enzim Aktivitesinin İzlenmesi

Spesifik bir enzimin aktivitesi, farklı dalga boylarında bir UV-spektrofotometre (Varian, Cary 50 Probe, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ABD) kullanılarak enzimatik aktivite deneylerine dayanarak belirlendi.

α-amilaz aktivitesi, DNS reaktifi (3,5-dinitrosalisilik asit) kullanılarak çözeltideki glikoz miktarındaki artışa dayalı olarak belirlendi. Absorbans, 540 nm dalga boyunda bir UV-Vis spektrofotometre ile ölçüldü.

Lipaz aktivitesi, 5 dakika boyunca 400 nm'de izlenen P-nitrofenol (pNP) reaksiyonuna göre belirlendi. Bir birim lipaz aktivitesi, substrat olarak p-nitrofenil butirat (PNPB) kullanılarak pH 7.2 ve 37 °C'de dakikada 1 nanomol p-nitrofenol salmıştır.

Proteaz aktivitesi, bir substrat olarak kazein kullanılarak ölçüldü. Proteaz aktivitesinin belirlenmesi için prosedür daha önce tarif edilmişti.

Peroksidaz aktivitesi, substrat olarak fenol, 4-aminoantipirin (4-AAP) ve hidrojen peroksit kullanılarak ölçüldü. Peroksidaz aktivitesini belirleme yöntemi ve peroksidaz aktivitesinin ayrıntılı bir hesaplama prosedürü önceki araştırmamızda yayınlanmıştır.

Farklı enzimlerin kalıntı aktiviteleri aşağıdaki Denklem (2) kullanılarak hesaplandı.

Tüm deneyler üç kopya halinde gerçekleştirildi ve ortalama değerler ortalama ± standart sapmayı ifade ediyor.

İstatistiksel Analiz R versiyonu 4.1.1 ve Rstudio, versiyon 1.4.1717, istatistiksel analizi gerçekleştirmek ve iki yönlü bir performanstan sonra doğal formdaki ve scCO2 ile muamele edilmiş unda enzim türleri içindeki kalıntı enzim aktivitesi arasındaki farkları değerlendirmek için kullanıldı. varyans analizi (ANOVA). Veriler normal dağıldı ve ortalama ve standart sapma ile sunuldu. Farklı gruplardaki enzimlerin inaktivasyonunu tanımlamak için bir post hoc Tuckey dürüst anlamlı fark testi yapıldı.

2.5. Pişirme Testi

Pişirme testi, unun ekmek yapmak için uygunluğunu belirlemek ve ekmek yapım sürecinde işlenmemiş ve scCO2 ile işlenmiş beyaz buğday unu arasındaki farkı belirlemek için geliştirilmiştir. Hlebček d.o.o, Pragersko, Slovenya fırınından alınan tarife göre hamur pişirme için bir SBB 850 F2, 850 W (SilverCrest, Lidl, Slovenya) ekmek yapma makinesi kullanıldı. Hamur 540 gr beyaz buğday unundan %1.8 maya, %2 tuz, %58 su ve %2.5 profesyonel hamur geliştirici içeren buğday unu, buğday glüteni, şeker, buğday maltı unu, un işleme ajanı ile hazırlanmıştır. (askorbik asit) ve enzimler (α-amilaz, hemiselülaz). Genel olarak fırınlar, ekmek üretimlerinde pişirme işlevselliğini geliştirmek için hamur geliştirici ekler. Bu amaçla, hem işlenmemiş hem de scCO2 uygulanmış beyaz buğday unu ile ekmek pişirmede aynı miktarda hamur geliştirici ilave edilmiştir. Malzemeler önce 10 dakika önceden ısıtıldı ve hamur 12 dakika karıştırıldı ve 20 dakika fermente edildi, daha sonra karıştırma ve mayalama 7 dakika ve 35 dakika boyunca tekrarlandı. Ekmek somunu 220 °C'de 60 dakika pişirildi. Hamur pişirme testi, işlem görmemiş beyaz buğday unu ve scCO2 işlemine tabi tutulmuş beyaz buğday unu ile aynı koşullar ve ekmek yapma programı altında tekrarlanmıştır. Soğutulduktan sonra ekmekler tartılmış ve hacimleri (cm3) suyla yer değiştirme yöntemi ile belirlenmiştir. Spesifik hacim (cm3/g), somun hacmi/ekmek ağırlığı olarak hesaplandı. Elde edilen değerler, üç tekrarın ortalamasıydı. Görünüm, aroma, tat ve doku gibi duyusal niteliklerin değerlendirilmesini içeren bir duyusal analiz gerçekleştirilmiştir. On eğitimsiz testçi (8 kadın ve 2 erkek, yaşları 26 ile 58 arasında değişiyor), işlenmemiş ve scCO2 ile işlenmiş beyaz buğday unundan pişmiş ekmeğin kabul edilebilirliği konusunda hedonik bir değerlendirme yaptı. Testte katılımcılara deney ekmeğindeki farklılıklara ilişkin tercihleri sorulmuştur. Pişmiş ekmeğin ortalama yüksekliği ölçülmüş ve ImageJ programı kullanılarak belirlenmiştir.

Devamı web sayfamızdadır…

Kaynak: MDPI AG (Multidisipliner Digital Publishing Institute)